klonering , karakterisering en expressieanalyse van de vitellogeninegenen vtgAo1 en vtgC tijdens de ontwikkeling van de eierstokken bij Chinese language haaksnuitkarper Opsariichthys bidens
Vitellogenese is essentieel voor de rijping van eicellen. Vitellogenine (Vtg), een dooiervoorlopereiwit, speelt een belangrijke rol bij oogenese en vitelogenese. Chinese language haaksnuitkarper Opsariichthys bidens is een economisch belangrijke zoetwatervis in China waarvan de voortplantings- en ontwikkelingsbiologie niet goed wordt begrepen. In deze studie hebben we histologische analyse uitgevoerd om de ontwikkeling van de eierstokken en oogenese in O. bidens te onderzoeken. De eierstokken werden verdeeld in stadia II-V en oöcyten werden verdeeld in perinucleaire oöcyten, corticale alveoli-oöcyten, vitelogene oöcyten en rijpe oöcyten.
CDNA-sequenties van volledige lengte werden gekloond van twee vtg-genen uit de lever van O. bidens, namelijk Ob-vtgAo1 en Ob-vtgC. Ob-vtgAo1 en Ob-vtgC cDNA zijn opgebouwd uit respectievelijk 4136 en 4392 basen en coderen voor eiwitten die respectievelijk 1335 en 1250 aminozuren bevatten. Ob-vtgAo1 bevat drie dooiereiwitdomeinen: lipovitelline zware keten (LvH), phosvitin (Pv) en lipovitelline lichte keten (LvL), terwijl Ob-VtgC LvH en LvL bevat, die onvolledige Vtgs zijn. Ob-vtgAo1- en Ob-vtgC-mRNA-expressie was important hoger in de lever van O. bidens dan in alle andere weefsels. In eicellen van stadium II-III eierstokken zijn dooierkorrels bijna afwezig en ovarium- en hepatische Ob-vtgAo1- en Ob-vtgC-expressieis laag. In stadium IV is de eicel gevuld met dooierkorrels en is de expressie van Ob-vtgAo1 en Ob-vtgC in de eierstokken en de lever aanzienlijk verhoogd. Gezamenlijk helpen deze bevindingen ons om vitelogenese in O. bidens beter te begrijpen.
Klonen , heterologe expressie en karakterisering van een nieuwe thioesterase uit natuurlijk monster
Een nieuw thioesterse-gen werd met succes rechtstreeks gekloond en gesequenced uit een natuurlijk monster van Domas Scorching Spring, West-Java, Indonesië. Homologische analyse van de sequentie toonde aan dat het gen een hoge homologie leek te hebben met thioesterase-genen en het hoogste met een vermeend thioesterase-gen van niet- gecultiveerde Acidilobus sp. JCHS bij 66% identiteit. Uit fylogenetische analyse bleek echter dat het eiwit met andere bekende thioesterasen van de vertakking was gescheiden. De grootte van het gen is ongeveer 500 basenparen , gelokaliseerd in een DNA-fragment van 2 kb uit een willekeurig PCR-amplicon. Het gen werd tot overexpressie gebracht in Escherichia coli , een dominante band verscheen bij 17 kDa in SDS-PAGE met een expressieniveau van ongeveer 32% van de totale eiwitten.
De activiteit van het gezuiverde eiwit met acetyl-CoA als substraat toonde aan dat het eiwit thioesterase-activiteit vertoonde. Verder vertoonde het enzym ook esterase-activiteit op p-nitrofenylester als substraat. Gedetailleerde karakterisering van esterolytische activiteit toonde aan dat het enzym p-nitrofenyldecanoaat als substraat prefereerde. De optimale activiteit van het enzym was bij 80°C en pH 8. De activiteit van het enzym werd gehandhaafd na incubatie bij 80°C tot 24 uur. Bovendien was het enzym gunstig voor polaire organische oplosmiddelen. Alle verkregen gegevens suggereerden dat het enzym een nieuwe alkalische thermostabiele thioesterase is.
Klonen , overexpressie en karakterisering van een thermostabiel, organisch oplosmiddel-tolerant laccase van Bacillus pumilus ARA en de toepassing ervan op kleurstofontkleuring
Een thermostabiel en organisch oplosmiddel-tolerant bacterieel laccase van Bacillus pumilus ARA is heteroloog tot expressie gebracht en gekarakteriseerd, dat potentieel ontkleuringsvermogen vertoont voor verschillende soorten industriële synthetische kleurstoffen. De optimale temperatuur en pH waren respectievelijk 85 °C en 3,5, terwijl het gezuiverde recombinante laccase BPLacc stabiel was onder 55-75°C en pH 5,0-8,Zero omstandigheden. De schijnbare kinetische parameters Ok m en V max van BPLacc voor ABTS als substraat waren 0,33 mM en 32,Four U / mg. Ethanol (1%, v/v) en methanol (2%, v/v) zouden de enzymactiviteit kunnen stimuleren. Het recombinante laccase behield meer dan 95% van zijn aanvankelijke activiteit in 10% (v/v) methanol.
De optimale expressieomstandigheden voor de laccaseproductie van BPLacc in LB-medium werden verkregen: inductietemperatuur van 25°C, 0,Four mM Cu2 + en 1,Zero mM IPTG toegevoegd aan de kweek. Na 5 uur was de uiteindelijke laccaseproductie 1283 U/mL. Bovendien nam de laccase-activiteit toe tot 4822 E/mL na een follow-up van 2 uur stationaire kweek, met ongeveer een 3,76-voudige toename. Het gezuiverde BPLacc was in staat om synthetische kleurstoffen in combinatie met mediatoren efficiënt te ontkleuren. Door 1,Zero mM ABTS toe te voegen , werd meer dan 90% van BRRB ontkleurd door het enzym, hetzij bij pH 4,Zero of pH 7,9. De uitstekende enzymatische eigenschappen suggereerden dat BPLacc geschikt zou kunnen zijn voor een brede toepassing in toekomstige biologische afbraakgebieden.
Voor het klonen van menselijk ABCB11-gen in E. coli moest een intragene Pribnow-Schaller-box worden verwijderd voordat deze werd ingebracht in de genomische veilige haven AAVS1-site met behulp van CRISPR-Cas9
Achtergrond: Genomische veilige havens zijn plaatsen in het genoom die veilig zijn voor geninsertie, zodat het ingevoegde gen goed zal functioneren en de verstoring van de genomische locatie geen voorzienbaar risico voor de gastheer oplevert. De AAVS1-site is de genetische locatie die wordt verstoord na integratie van adeno-geassocieerd virus (AAV) en wordt beschouwd als een ‘veilige haven’ in het menselijk genoom omdat ongeveer een derde van de mensen is geïnfecteerd met AAV en tot nu toe is er geen apodictisch bewijs dat AAV pathogeen is of dat verstoring van AAVS1 een ziekte bij de mens veroorzaakt. Daarom hebben we ervoor gekozen om de AAVS1-site te targeten voor de invoeging van ABCB11, een galzuurtransporteur die defect is in progressieve familiale intrahepatische cholestase type-2 (PFIC-2), een dodelijke ziekte van kinderen waarbij cytotoxische galzouten zich ophopen in hepatocyten en hen en uiteindelijk de patiënt doden.
Methoden : We gebruikten de CRISPR Cas9, een genoombewerkingssysteem om het ABCB11- gen op de AAVS1-plaats in menselijke cellijnen in te voegen .
Resultaten: We vonden dat menselijke ABCB11 sequentie een “Pribnow- Schaller Field” dat zijn expressie in bacteriën en expressie van ABCB11 eiwit dat toxisch maakt E . coli ; de verwijdering hiervan was vereist voor succesvol klonen. We hebben ABCB11 ingevoegd op de AAVS1-site in HEK 293T met behulp van de CRISPR-Cas9-tool. We vonden ook dat de ABCB11 eiwit heeft gelijkenis met E . coli endotoxine (lipide A) transporter MsbA. Conclusies: we hebben ABCB11 ingevoegd op de AAVS1-site met behulp van CRISPR-Cas9 ; de frequentie van homologe recombinatie was echter erg laag om deze benadering succesvol te laten zijn in vivo .
Moleculaire klonering en karakterisering van CD63 bij gewone karper geïnfecteerd met koi herpesvirus
CD63 is een lid van de vier-transmembraan-domein eiwit superfamilie en is het eerste gekarakteriseerde tetraspanine eiwit. In de huidige studie hebben we de gewone karper (Cyprinus Carpio) CD63 (ccCD63) sequentie gekloond en ontdekten dat de ccCD63 ORF 711 bp bevatte en codeerde voor een eiwit van 236 aminozuren. Homologie-analyse onthulde dat de volledige ccCD63-sequentie 84,08% aminozuurovereenkomst had met CD63 van Sinocyclocheilus anshuiensis. Subcellulaire lokalisatieanalyse onthulde dat ccCD63 gelokaliseerd was in het cytoplasma. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) analyse gaf aan dat ccCD63 tot expressie werd gebracht in de kieuw, darm, lever, milt, hersenen en nier, met een hogere expressie in milt en hersenweefsel dan in de andere onderzochte weefsels.
Na infectie met het koi-herpesvirus (KHV) vertoonden deze weefsels verschillende expressieniveaus van ccCD63. Het expressieniveau was het laagst in de lever en het hoogst in de hersenen; het expressieniveau in de hersenen was 8,7 keer hoger dan dat in de lever. Bovendien bevorderde de knockdown van ccCD63 de KHV-infectie. Bovendien was ccCD63 gecorreleerd met de regulatie van RIG-I/MAVS/TRAF3/TBK1/IRF3 en kan het betrokken zijn bij de antivirale respons through de RIG-I-signaalroute voor virale herkenning op een TRAF3/TBK1-afhankelijke manier. Alles bij elkaar genomen suggereerden onze resultaten dat ccCD63 de interactie van KHV met het immuunsysteem van de gastheer opreguleerde en de verspreiding van KHV onderdrukte.
Optimaliseren quantum klonen ketenparameters foundation van adaptieve differentiële geleide evolutie algoritme
Introductie: Quantum-kloneringsoperatie, begonnen met een no-go-stelling die aantoonde dat er geen mogelijkheid is om een kloneringsoperatie uit te voeren op een onbekende kwantumtoestand, maar een aantal proeven hebben aangetoond dat we bij benadering de kwantumtoestand-klonering kunnen maken die nog steeds met enige fouten.
Doelstellingen: Voor zover wij weten, is dit artikel de eerste in zijn soort die probeert metaheuristische algoritmen zoals Adaptive Guided Differential Evolution (AGDE) te gebruiken om het probleem van kwantumkloneringscircuitparameters aan te pakken om de kloneringsgetrouwheid te verbeteren.
Methoden: Om de effectiviteit van de AGDE te onderzoeken , hebben de uitgebreide experimenten aangetoond dat de AGDE uitstekende prestaties kan leveren in vergelijking met andere bekende meta-heuristieken, waaronder; Verbeterd LSHADE-SPACMA-algoritme (ELSHADE-SPACMA) , verbeterd differentieel evolutie-algoritme met nieuwe aanpassing van besturingsparameters (PaDE), verbeterd multi-operator differentieel evolutie-algoritme (IMODE), parameters met adaptief leermechanisme (PALM), QUasi-Affine TRansformation Evolutionair algoritme (QUATRE), Particle Swarm Optimization (PSO) , Gravitational Search Algorithm (GSA), Cuckoo Search (CS), Bat-geïnspireerd algoritme (BA), Grey Wolf Optimizer (GWO) en Whale Optimization Algorithm (WOA).
Conclusie: Dienovereenkomstig bewezen de kwalitatieve en kwantitatieve metingen, inclusief gemiddelde, standaarddeviatie, convergentiecurven van de competitieve algoritmen over 30 onafhankelijke runs , de superioriteit van AGDE om de kloneringsgetrouwheid te verbeteren.
