Moleculaire klonering en karakterisering van een thermostabiel en halotolerant endo-β-1,4-glucanase van Microbulbifer sp. ALW1
De bacterie Microbulbifer sp. ALW1 werd eerder gekarakteriseerd met het vermogen om de celwand van bruine algen in fijne stukjes af te breken. De biologische functies van stam ALW1 moesten nog worden opgehelderd. In deze studie werd een gen, namelijk MaCel5A , geïsoleerd uit het ALW1-stamgenoom, dat codeert voor een endo-β-1,4-glucanase. MaCel5A werd fylogenetisch gecategoriseerd onder de glycosidehydrolase-familie GH5, met de hoogste identiteit met een vermeende cellulase van Microbulbifer-thermotolerans . Het recombinante MaCel5A-eiwit gezuiverd uit heterologe expressie in E. coli vertoonde maximale activiteit bij respectievelijk 50 °C en pH 6,Zero en functioneerde selectief in de richting van carboxymethylcellulose en gerst-can-glucaan.
Recombinant MaCel5A vertoonde een aanzienlijke tolerantie voor blootstelling aan hoge temperaturen tot 80 °C gedurende 30 minuten met behoud van 49% resterende activiteit. Bovendien vertoonde MaCel5A matige stabiliteit tegen pH 5,0-11,Zero en sterke stabiliteit in aanwezigheid van niet-ionische oppervlakteactieve stof. MaCel5A vertoonde een sterke halo-stabiliteit en halotolerantie. De activiteit van het enzym nam ongeveer tien keer toe bij 0,5 M NaCl en ongeveer vijf keer zelfs bij 4,Zero M NaCl in vergelijking met de enzymactiviteit zonder toevoeging van zout. De twee geconserveerde glutaminezuurresiduen in MaCel5A vertoonden de typische katalytische zuur/base- en nucleofiele machinerie van glycosidehydrolasen. Deze kenmerken benadrukken het industriële toepassingspotentieel van MaCel5A.
Klonen en fysieke lokalisatie van door mannen vooringenomen repetitieve DNA-sequenties in Spinacia oleracea (Amaranthaceae)
Spinazie ( Spinacia oleracea Linnaeus, 1753) is een ideaal materiaal voor het bestuderen van moleculaire mechanismen van de vroege geslachtschromosoomevolutie in tweehuizige planten. Gedegenereerde oligonucleotide-geprimede polymerasekettingreactie (DOP-PCR) techniek vergemakkelijkt de retrotransposon-relevante research door het verrijken van specifieke repetitieve DNA-sequenties van een micro-ontleed enkel chromosoom. We hebben genomische subtractieve hybridisatie uitgevoerd om geslachtsafhankelijke DNA-sequenties te screenen met behulp van de DOP-PCR-amplificatieproducten van micro-ontleed spinazie Y-chromosoom.
De screening leverde 55 mannelijke DNA-sequenties op met een lengte van 30 576 bp , waarvan 32 DNA-sequenties (12 049 bp) herhaalde DNA-sequenties bevatten, waaronder LTR/Copia , LTR/Gypsy , eenvoudige herhalingen en DNA/CMC-EnSpm . Van deze repetitieve DNA-sequenties werden vier DNA-sequenties die een fragment van Ty3-gypsy retrotransposons (SP73, SP75, SP76 en SP77) bevatten, geselecteerd als fluorescentieprobes voor hybridisatie op mannelijke en vrouwelijke spinazie-karyotypen. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) signalen van SP73 en SP75 werden meestal vastgelegd op de centromeren en hun omgeving voor elke homoloog. Hybridisatiesignalen verschenen voornamelijk in de buurt van de vermeende centromeren voor elke homologechromosoompaar met behulp van SP76- en SP77-sondes voor FISH, en er waren sporadische signalen op de lange armen. De resultaten kunnen als foundation dienen om de functie van repetitieve DNA-sequenties in de evolutie van geslachtschromosomen in spinazie te bestuderen.
osteoporoseliga
Moleculaire klonering en functionele karakterisering van het TaIRI9-gen in tarwe (Triticum aestivum L.)
De vernalisatie van tarwe is een van de belangrijke factoren die het plantgebied, de introductie en de teelttechnieken van tarwe bepalen. De bekende vernalisatie- genen (moleculaire marker) kunnen de vernalisatie-eis van wintertarwerassen echter niet precies onderscheiden. Daarom is het belangrijk om nieuwe vernalisatiegenen te onderzoeken en het mechanisme van vernalisatieregulatie op te helderen. Om het genennetwerk in de vernalisatieroute te onderzoeken, hebben we het TaIRI9-gen (ice rekristallisatieremmerproteïne) gescreend dat is geassocieerd met het expressieprofiel van de vernalisatiebehandeling van wintertarwe Jing 841. Overexpressie van TaIRI9 in wildtype tarwe resulteerde in verminderde planthoogte, verhoogd aantal helmstokken en vertraagde koersdagen.
Na een vernalisatiebehandeling bij 4°C gedurende 30, 35, 45 of 50 dagen vertoonden TaIRI9-overexpressielijnen een verhoogde behoefte aan vernalisatie en vertraagde koerstijd dan wildtype, wat aangeeft dat TaIRI9 het vernalisatieproces van tarwe kan beïnvloeden. Daarnaast werd de expressie van de TaIRI9-genen geanalyseerd in winter Jing 841, sterke wintertarwecultivar Xindong 18 en tien recombinante inteeltlijnen (RIL’s, Hussar x Yanzhan1). De gegevens toonden aan dat de expressie van TaIRI9 positief geassocieerd was met de vereiste van vernalisatie. Deze resultaten gaven aan dat TaIRI9 de koers en bloeitijd in tarwe reguleert door VRN2 te bevorderen en bloeipromotor VRN1 en VRN3 te remmen.en kan betrokken zijn bij de reguleringsroute voor tarwevernalisatie. Bulked segregant CGT-Seq-gefaciliteerde kaartgebaseerde klonering van een echte meeldauwresistentiegen afkomstig van wilde emmertarwe (Triticum dicoccoides)
Echte meeldauw, veroorzaakt door Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt), is een wereldwijd voorkomende bladziekte van tarwe. Wilde emmertarwe (WEW, Triticum dicoccoides) (AABB, 2n=4x=28), de stamvader van de gekweekte tetraploïde en hexaploïde tarwe, is zeer resistent tegen echte meeldauw en in deze wilde soort zijn veel resistentie-allelen geïdentificeerd .
Klonering en karakterisering van een nieuw DNase-gen van Trichogramma pretiosum
DNase is een krachtig hulpmiddel voor een reeks moleculair-biologische toepassingen. Het ontwikkelen van een strategie voor grootschalige productie van DNase met hoge zuiverheid en activiteit is van cruciaal belang voor wetenschappelijk onderzoek. In deze studie werd een voorheen niet-gekarakteriseerd gen met nuclease-activiteit gevonden in het Trichogramma pretiosum-genoom. Pichia pastoris GS115 had de voorkeur als gastheer om de problemen met betrekking tot prokaryotische expressie te overwinnen. Onder de optimale omstandigheden bereikte de activiteit van T. pretiosum DNase (Tp-DNase) 1940 U/ml kweeksupernatant bij fed-batch fermentatie. Met behulp van ionenuitwisselingschromatografie en adsorptiechromatografie werd Tp-DNase geproduceerd met een zuiverheid van > 99% en een molecuulgewicht van 45 kDa.
In vitro DNA-degradatie-experimenten toonden aan dat Tp-DNase dsDNA effectief kon afbreken, en de activiteit ervan was iets hoger dan die van runder-pancreas-DNase I onder dezelfde omstandigheden. Bovendien kan Tp-DNase worden gebruikt om nucleïnezuurcontaminatie te elimineren en de nauwkeurigheid van nucleïnezuurdetectie te verbeteren .
Klonering , expressie en karakterisering van Baeyer-Villiger monooxygenases van eukaryote Exophiala jeanselmei stam KUFI-6N
De schimmel Exophiala jeanselmei-stam KUFI-6N produceert een uniek cycloalkanon-mono-oxygenase (ExCAMO) dat een ongebruikelijk substraatspectrum van Baeyer-Villiger-oxidatie van 4-10-ledige ringketonen vertoont. In deze studie wilden we het gen identificeren en sequencen dat codeert voor ExCAMO van KUFI-6N en het gen tot overexpressie brengen in Escherichia coli. We ontdekten dat de primaire structuur van ExCAMO het nauwst verwant is aan het cycloalkanonmono-oxygenase van Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011, met een aminozuuridentiteit van 54,2%. ExCAMO werd functioneel tot expressie gebracht in Escherichia coli en het substraatspectrum en de kinetische parameters ervan werden onderzocht.
Substraatprofilering gaf aan dat ExCAMO ongebruikelijk is onder bekende Baeyer-Villiger mono-oxygenasen vanwege het vermogen om een verscheidenheid aan substraten te accepteren, waaronder C4-C12-ringketonen. ExCAMO heeft een hoge affiniteit en katalytische efficiëntie voor cycloalkanonen, waarvan de hoogste voor cyclohexanon. Vijf andere genen die coderen voor Baeyer-Villiger mono – oxygenasen werden ook gekloond en tot expressie gebracht in Escherichia coli.
Description: Human secreted CD28-Fc fusion protein, also known as TP44, GenBank Accession No. NM_006139, a.a 19-152, expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 41.4 kDa (monomer). This protein runs at a higher M.W. by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human herpesvirus entry mediator A, also known as HVEM, TNFRSF14, CD270, and HVEA, GenBank Accession No. NM_003820, a.a. 37-202 fused to human IgG1 Fc, expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 44.2 kDa. This protein runs at a higher M.W. by SDSPAGE due to glycosylation.
Description: Human secreted CD40, Fc fusion protein, also known as Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 5, TNFRSF5, and Bp50, GenBank Accession No. NM_001250, a.a. 21-193 expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 45.9 kDa (monomer). This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human secreted CD27, Fc fusion protein, also known as Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 7, TNFRSF7, and T14, GenBank Accession No. NM_001242, a.a. 21-192 expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 45.8 kDa (monomer). This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human CD47, Fc fusion protein, also known as leukocyte surface antigen CD47, Rh-related antigen, integrin-associated protein, antigenic surface determinant protein OA3, antigen identified by monoclonal antibody 1D8, IAP, and MER6. GenBank Accession No. NM_001777, a.a. 19-139 expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 40 kDa. This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human T-cell immunoreceptor with Ig and_x000D_ITIM domains (TIGIT), also known as V-set_x000D_and immunoglobulin domain-containing_x000D_protein 9, VSIG9, V-set and transmembrane_x000D_domain-containing protein 3, and VSTM3,_x000D_GenBank Accession No. NM_173799, a.a._x000D_22-141 fused to Fc region of human IgG,_x000D_expressed in a HEK293 cell expression_x000D_system. MW = 39.7 kDa. This protein runs_x000D_at a higher MW by SDS-PAGE due to_x000D_glycosylation.
Description: Human CD44, also known as epican, extracellular matrix receptor III, GP90 lymphocyte homing/adhesion receptor, HUTCH-I, or phagocytic glyco-protein I (PGP-1), GenBank Accession No. NM_000610, a.a. 21-220, fused with Fc region of human IgG, expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 48.7 kDa. This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Rhesus monkey angiotensin I converting enzyme 2 (ACE2), also known as ACEH, Genbank Accession No.: ACI04553.1, a.a. 18-739, fused at the C-terminus of the Fc portion of human IgG1, expressed in a HEK293 expression system, MW= 119 kDa. This protein runs at a higher MW due to glycosylation.
Description: Rhesus monkey angiotensin I converting enzyme 2 (ACE2), also known as ACEH, Genbank Accession No.: ACI04553.1, a.a. 18-739, fused at the C-terminus of the Fc portion of human IgG1, expressed in a HEK293 expression system, MW= 119 kDa. This protein runs at a higher MW due to glycosylation.
Description: Human IL-6 Receptor, Genbank # NM_000565, a.a. 20-365 with C-terminal fusion to human IgG1 Fc region, expressed in HEK293 cells. MW = 65 kDa + glycans.
Description: Human IL-6 Receptor, Genbank # NM_000565, a.a. 20-365 with C-terminal fusion to human IgG1 Fc region, expressed in HEK293 cells. MW = 65 kDa + glycans.
Description: Human secreted lymphotoxin beta receptor_x000D_(LTBR)-Fc fusion protein, also known as_x000D_Tumor Necrosis Factor C Receptor_x000D_(TNFCR), and CD18, GenBank Accession_x000D_No. NM_002342, a.a 28-219, expressed in_x000D_a HEK293 cell expression system. MW = 48_x000D_kDa (monomer). This protein runs at a_x000D_higher apparent M.W. by SDS-PAGE due to_x000D_glycosylation.
Description: Mouse secreted lymphotoxin beta receptor_x000D_(mLTBR)-Fc fusion protein, also known as,_x000D_Tumor Necrosis Factor C Receptor_x000D_(TNFCR), and CD18, GenBank Accession_x000D_No. NM_010736, a.a 28-221, expressed in_x000D_a HEK293 cell expression system. MW =_x000D_48.8 kDa (monomer). Endotoxin level_x000D_<0.001 EU/ug.This protein runs at a higher_x000D_apparent M.W. by SDS-PAGE due to_x000D_glycosylation.
Description: Secreted frizzled receptor (FZD1)-Fc fusion_x000D_protein and WNT receptor, also known as_x000D_FZD1, GenBank Accession No.BC_051271,_x000D_a.a. 73-253, expressed in a HEK293 cell_x000D_expression system. MW = 46.4 kDa_x000D_(monomer). This protein runs at a higher_x000D_apparent M.W. by SDS-PAGE due to_x000D_glycosylation.
Description: Secreted frizzled receptor (FZD10)-Fc_x000D_fusion protein and WNT receptor, also_x000D_known as FZD10, GenBank Accession No._x000D_BC_074997, a.a. 21-161, expressed in a_x000D_HEK293 cell expression system. MW = 42.7_x000D_kDa (monomer). This protein runs at a_x000D_higher apparent M.W. by SDS-PAGE due to_x000D_glycosylation.
Description: Secreted frizzled receptor (FZD4)-Fc fusion_x000D_protein and WNT receptor, also known as_x000D_FZD4, GenBank Accession No._x000D_BC_114527, a.a. 37-180, expressed in a_x000D_HEK293 cell expression system. MW = 42.9_x000D_kDa (monomer). This protein runs at a_x000D_higher apparent M.W. by SDS-PAGE due to_x000D_glycosylation.
Description: Secreted frizzled receptor (FZD7)-Fc fusion_x000D_protein and WNT receptor, also known as_x000D_FZD7, GenBank Accession No._x000D_BC_015915, a.a. 33-185, expressed in a_x000D_HEK293 cell expression system. MW = 43.3_x000D_kDa (monomer). This protein runs at a_x000D_higher apparent M.W. by SDS-PAGE due to_x000D_glycosylation.
Description: Human B- and T-lymphocyte attenuator (BTLA)-Fc fusion protein, also known as CD272, GenBank Accession No. NM_181780, a.a. 31-150, expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 40.3 kDa (monomer). This protein runs at a higher apparent M.W. by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human secreted LAG3, Fc fusion protein, also known as Lymphocyte-Activation Gene 3 and CD223. GenBank Accession No. NM_002286, a.a. 23-450 expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 73.1 kDa (monomer). This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human secreted CTLA4 , Fc fusion protein, also known as Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 and CD152. GenBank Accession No. NM_005214, a.a. 36-162 expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 40.3 kDa (monomer). This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human secreted TIM-3, Fc fusion protein, also known as T-cell immunoglobulin mucin receptor 3, T-cell membrane protein 3, T-cell and immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3, TIMD-3, Hepatitis A virus cellular receptor 2, and HAVCR-2. GenBank Accession No. NM_032782.4, a.a. 22-200 expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 46.5 kDa. This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human secreted GITR, Fc fusion protein, also known as Glucocorticoid-induced TNFR-Related Protein, Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily member 18, TNFRSF18, Activation-Inducible TNFR Family Receptor, AITR, and CD357, GenBank Accession No. NM_004195, a.a. 26-161 expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 41.2 kDa (monomer). This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human secreted OX40, Fc fusion protein,_x000D_also known as Tumor Necrosis Factor_x000D_Receptor Superfamily Member 4,_x000D_TNFRSF4, and CD134, GenBank_x000D_Accession No. NM_003327, a.a. 29-216_x000D_expressed in a HEK293 cell expression_x000D_system. MW = 46.8 kDa (monomer). This_x000D_protein runs at a higher MW by SDS-PAGE_x000D_due to glycosylation.
Description: Human ICOS, Fc fusion protein, also known as inducible T-cell costimulator and CD antigen 278, activation-inducible lymphocyte immunomediatory molecule, AILIM, CD278, and CVID1. GenBank Accession No. NM_012092, a.a. 21-140 expressed in a HEK293 cell expression system. MW = 40.2 kDa. This protein runs at a higher MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
Description: Human CD226 antigen also_x000D_known as DNAX accessory molecule 1_x000D_(DNAM-1), GenBank Accession No._x000D_NM_006566, a.a. 19-247 fused to Fc region_x000D_of human IgG1, expressed in a HEK293 cell_x000D_expression system. MW = 52.8 kDa_x000D_(monomer). This protein runs at a higher_x000D_MW by SDS-PAGE due to glycosylation.
