Klonen van aan symbiose gerelateerde cDNA’s van eucalyptus ectomycorrhiza door middel van PCR-ondersteunde differentiële screening
Als onderdeel van een challenge om symbiose-gerelateerde genen te identificeren , rapporteren we hier een eenvoudige differentiële screeningprocedure voor het isoleren van op- en neerwaarts gereguleerde schimmeltranscripten uit een cDNA-bibliotheek van de zich ontwikkelende Eucalyptus globulus-Pisolithus tinctorius-mycorrhiza. cDNA-inserts van willekeurig geselecteerde λZAP- plaques werden geamplificeerd door PCR en gescheiden door agarosegelelektroforese.
De met PCR geamplificeerde cDNA- monsters werden vervolgens gescreend door middel van Southern-blotting, met gebruikmaking van radioactief gemerkte cDNA-probes met hoge specifieke activiteit. We hebben deze methode toegepast op schimmeltranscripten die tijdens de vroege stadia van ontwikkeling differentieel tot expressie worden gebracht in ectomycorrhiza’s. We schatten dat ongeveer 50% van de schimmel-mRNA-populatie wordt gereguleerd door de ontwikkeling van de symbiose; verschillende op- en neerwaarts gereguleerde cDNA’s zijn geïsoleerd voor verdere analyse.
Moleculair klonen van muis homoloog van glazuurproteïne C4orf26 en de fosforylering ervan door FAM20C
Het wordt algemeen aanvaard dat cellulaire processen worden gecontroleerd door eiwitfosforylering en het is steeds duidelijker geworden dat eiwitafbraak, lokalisatie en conformatie, evenals eiwit-eiwitinteractie, de voorbeelden zijn van daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen die worden gemoduleerd door eiwitfosforylering. Emailmatrixeiwitten behoren tot leden van de secretoire calciumbindende fosfoproteïnefamilie (SCPP) geclusterd op chromosoom 4q21, en de meeste SCPP-fosfoproteïnen hebben ten minste één SXE-motief (S; serine, X; elk aminozuur, E; glutaminezuur). Er is gemeld dat mutaties in het C4orf26-gen , dat zich op chromosoom 4q21 bevindt, geassocieerd zijn met het autosomaal recessieve sort Amelogenesis Imperfecta (AI), een erfelijke aandoening die de vorming/mineralisatie van glazuur beïnvloedt.
Het glazuurfenotype dat wordt waargenomen bij patiënten met C4orf26-mutaties is gehypomineraliseerd en gedeeltelijk hypoplastisch, wat aangeeft dat C4orf26-eiwit kan functioneren in zowel secretoire als rijpingsstadia van amelogenese. De vorige in vitro-studie toonde aan dat het synthetische gefosforyleerde peptide op foundation van de C4orf26-eiwitsequentie de nucleatie van hydroxyapatiet versnelt. Hier tonen we de moleculaire klonering van Gm1045, muishomoloog van C4orf26, die 2 splicing-isovormen heeft. Immunohistochemische analyse toonde aan dat de immunolokalisatie van Gm1045 voornamelijk wordt waargenomen in glazuurmatrix in vivo. Ons rapport is het eerste dat aantoont dat FAM20C, het Golgi-caseïnekinase, C4orf26 en Gm1045 in celculturen fosforyleert. De extracellulaire lokalisatie van C4orf26/Gm1045 werd gereguleerd door FAM20Ckinase-activiteit. Onze gegevens wijzen dus op het biologische belang van glazuurmatrix-kinase-controle van SCPP-fosfoproteïnen en kunnen een brede affect hebben op de regulatie van amelogenese en AI.
Moleculair klonen , immunologische karakterisering en expressie-analyse van gonadotropine-releasing hormoon (GnRH) in de hersenen van de Chinese language alligator tijdens verschillende stadia van de voortplantingscyclus
Het neurohormoon gonadotropine-releasing hormoon (GnRH) speelt een essentiële rol bij de controle van reproductieve functies bij gewervelde dieren. Het complementaire DNA (cDNA) van volledige lengte dat codeert voor de GnRHs-precursor en zijn rol in de reproductieve cycli die reguleren, is echter niet geïllustreerd in krokodilachtige soorten. In de huidige studie werden cDNA’s van volledige lengte die coderen voor GnRH1-vormen , de overheersende lokalisatie ervan in hersenen en perifere weefsels en GnRH1-peptideconcentraties in de hypothalamus en hypofyse in relatie tot seizoensgebonden gonadale ontwikkeling van Chinese language alligator onderzocht.
Het cDNA van GnRH1 bestaat uit een open leesraam van 282 bp dat codeert voor 93 aminozuren. De afgeleide aminozuursequentie van alligator GnRH1 bevat verschillende geconserveerde gebieden en vertoont een nauwere genetische verwantschap met de vogelsoorten dan met andere reptielensoorten. De GnRH1-immunopositieve cellen werden niet alleen op grote schaal gedetecteerd in de grote hersenen, diencephalon, medulla oblongata maar ook waargenomen in perifere weefsels, deze wijdverspreide distributiekenmerken gaven aan dat GnRH1 mogelijk de multifunctionaliteit bezitin Chinese language Alligator. De GnRH1-peptideconcentratie in de hypothalamus was de hoogste in de RP-groep (P<0,05), in verband met een piekwaarde in GSI en het verschijnen van late vitelogene follikels in de eierstok. Alles bij elkaar genomen suggereerden onze resultaten dat GnRH1 voornamelijk betrokken was bij het vitelogeneseproces van seizoensgebonden gonadale ontwikkeling van Chinese language Alligator.
Klonen , expressie, karakterisering en weefselverdeling van cystatine C van zilverkarper (Hypophthalmichthys molitrix)
Cystatines zijn eiwitten die cysteïneproteasen remmen, zoals papaïne. In deze studie werd het cystatine C- gen van 336 bp (familie II, Hm CysC ) van zilverkarper ( Hypophthalmichthys molitrix ) gekloneerd en tot expressie gebracht in Escherichia coli BL21 (DE3). Hm CysC codeert voor het rijpe peptide van cystatine C (HmCystatin C), met 111 aminozuren. Een typisch QXXXG-motief werd gevonden in HmCystatin C en het vormde een cluster met Cyprinus carpio en Danio rerio cystatine C in de fylogenetische growth. Kwantitatieve realtime-analyse van de polymerasekettingreactie gaf aan dat Hm CysC werd op verschillende niveaus getranscribeerd in vijf geteste weefsels van zilverkarper.
Na zuivering met Ni 2+ – nitrilotriazijnzuur-agarose- affiniteitschromatografie, vertoonde HmCystatine C een molecuulgewicht van 20 kDa in natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Gezuiverd HmCystatine C had sterke remmende effecten op de proteolytische activiteit van papaïne. Immunochemische kleuring met anti-HmCystatin C-antilichaam toonde aan dat HmCystatin C wijd verspreid was in zilverkarperweefsels. Deze resultaten demonstreerden gezamenlijk de eigenschappen van HmCystatin C, wat informatie verschaft voor verder onderzoek naar cystatines van visorganismen.
Klonen en expressie van meerdere metallothioneïnen van hybride populier
- In een poging om processen te begrijpen die verband houden met de opslag van zware metalen, hebben we zes metallothioneïne-genen (PtdMT’s) gekarakteriseerd in de hybride cottonwood, Populus trichocarpa × deltoides.
- cDNA-microarrays en reverse transcriptase-polymerase kettingreactie werden gebruikt om PtdMT-expressie in populierweefsels te onderzoeken. Ze vertoonden differentiële genexpressiepatronen, die geassocieerd kunnen zijn met de various rollen en functies die PtdMT’s hebben bij het omgaan met bepaalde ontwikkelings- (bijv. wortelontwikkeling en bladveroudering) en omgevingsfactoren.
- De heterologe expressie in een cadmium (Cd)-overgevoelige gistmutant toonde het vermogen van PtdMT-cDNA’s om Cd-tolerantie te verlenen.
De concentratie van PtdMT-mRNA’s werd verhoogd door zink, maar niet door koper en Cd. • Verdere research zullen helpen om de rol van metallothioneïne-genen in metaalhomeostase en populierontwikkeling te verduidelijken, en om populiergenotypes te isoleren die bijzonder tolerant zijn voor stress voor gebruik in experimenten met fytoremediatie.

Useless Cas9-sgRNA Advanced Shelters Kwetsbare DNA restrictie-enzym plaatsen van Cleavage voor Klonen Functions
De creatie van het nuclease-dode Cas-eiwit (dCas9) biedt een nieuw platform voor een overvloed aan nieuwe ontdekkingen. Er zijn various dCas9-tools ontwikkeld voor transcriptieregulatie, epigenetische manipulatie, basisbewerking, genoombeeldvorming, genetische schermen en chromatine-immunoprecipitatie. Hier laten we zien dat dCas9 en single-guide RNA voorgemonteerd om ribonucleoproteïne dCas9-sgRNA te vormen (aangeduid als dRNP) in staat is om specifiek en omkeerbaar de activiteit van DNA-splitsing door restrictie-enzymen (RE’s) te blokkeren.
We laten zien dat de remming van RE-activiteiten optreedt wanneer de herkennings- of de splitsingsplaats van het DNA wordt overlapt door het sgRNA of de aangrenzende motiefsequentie van de protospacer . Verder laten we zien dat meerdere dRNP’s tegelijkertijd kunnen worden gebruikt om meer dan één RE-sites te remmen. Als zodanig hebben we deze nieuwe bevinding gebruikt als een methode om aan te tonen dat inserts kunnen worden geligeerd in vectoren, en vice versa , waarbij selectieve RE-sites tijdelijk worden afgeschermd om de gewenste klonering mogelijk te maken.
Klonen , mitochondriale vervanging en genoombewerking: 25 jaar ethisch debat sinds Dolly
De geboorte van het schaap Dolly in 1996 ontlokte een tsunami aan commentaren, zowel in de populaire media als in academische tijdschriften, inclusief reacties op het vooruitzicht van reproductief klonen van mensen. Veel van de bezorgdheid die werd geuit over dit ingebeelde gevolg van Dolly’s ontstaan, onthulde fundamentele zorgen over het verlies van onze toewijding aan bepaalde ethische goederen, zoals menselijke waardigheid, of zelfs ‘wat het betekent om mens te zijn’. In de afgelopen 25 jaar is de focus van een groot deel van het ethische debat over menselijke biotechnologie langzaam verschoven naar andere genetische technologieën die gericht zijn op het beïnvloeden van overerving, zoals mitochondriale vervangingstechnieken (MRT) en erfelijke genoombewerking.
Vooral genoombewerking is een technologie met meerdere toepassingsgebieden , actueel en potentieel, in onderzoek en innovatie. In deze evaluate suggereer ik dat veel van de fundamentele zorgen over de mogelijkheid van reproductief klonen van mensen die door Dolly zijn veroorzaakt, vandaag de dag voortduren in de argumenten van degenen die zich verzetten tegen MRT en elk gebruik van erfelijke menselijke genoombewerking (HHGE).
Hoewel ik niet accepteer dat een begrip van de menselijke natuur en waardigheid alleen de ethische onaanvaardbaarheid van dergelijke geassisteerde voortplantingstechnologieën kan aantonen, zijn er thema’s van rechtvaardigheid, die zich uitstrekken tot onze relaties met dieren, die voortdurend uitgebreid onderzoek en openbare beraadslaging vereisen. Dolly heeft een lange schaduw geworpen over dergelijke discussies, maar ik suggereer dat de algemene existentiële angst voor het menselijk gebruik van biotechnologie die ze ging symboliseren, noch een verplichte, noch een betrouwbare gids is voor hoe we vandaag over biotechnologie moeten denken.